KROMATOGRAFI

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.

Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisa dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisa lebih lanjut. Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS).


Jenis Kromatografi
1. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan salah satu metode pemisahan konvensional karena inilah awal dari metode kromatografi. Dalam kromatografi kolom, pertama-tama kolom gelas dengan kran pada salah satu ujungnya diisi oleh fasa diam berupa silika atau alumina. Ukuran diameter partikel fasa diam berkisar 100µm. Campuran yang akan dipisahkan dituangkan pada bagian atas kolom yang berisi fasa diam. Begitu pula fasa gerak berupa pelarut organik seperti heksan atau eter dialirkan dari bagian atas kolom. Komponen-komponen yang telah terpisah dari campurannya bergerak terbawa fasa gerak ke bawah kolom. Jumlah komponen penyusun campuran dapat terlihat sebagai cincin-cincin berwarna sepanjang kolom gelas. Akhirnya, komponen-komponen dari campuran meninggalkan kolom gelas satu persatu dan dapat ditampung pada tempat yang berbeda.

2. Kromatografi Gas
Dalam kromatografi gas, gas digunakan sebagai fasa gerak dan zat padat atau zat cair digunakan sebagai fasa diam. Mekanisme kerja kromatografi gas adalah sebagai berikut : gas dalam silinder baja bertekanan tinggi dialirkan melalui kolom yang berisi fasa diam. Cuplikan berupa campuran yang akan dipisahkan, biasanya dalam bentuk larutan, disuntikkan ke dalam aliran gas tersebut. Kemudian cuplikan dibawa oleh gas pembawa ke dalam kolom dan di dalam kolom terjadi proses pemisahan. Komponen-komponen campuran yang telah terpisahkan satu persatu meninggalkan kolom. Suatu detektor diletakkan di ujung kolom untuk mendeteksi jenis maupun jumlah tiap komponen campuran. Hasil pendeteksian direkam dengan rekoerder dan dinamakan kromatogram yang terdiri dari beberapa peak. Pengukuran kromatografi gas dapat dilakukan dalam dua mode operasional yaitu mode isotermal dan mode program suhu. Dengan mode isotermal, suhu kolom dijaga tetap selama pengukuran sedangkan pada mode program suhu, suhu kolom dapat diprogram. Untuk hasil yang baik maka harus diperhatikan beberapa faktor pendukung yakni pemilihan fasa diam yang harus disesuaikan dengan cuplikan yang akan dipisahkan dan didarkan pada sifat kepolaran cuplikan. Pemilihan detektor ditentukan oleh struktur molekul cuplikan.

3. Kromatografi Cair (Liquid Chromatography)
Kromatografi cair merupakan teknik yang tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu larutan. Jika larutan sampel berinteraksi dengan fase stasioner, maka molekul-molekul didalamnya berinteraksi dengan fase stasioner; namun interaksinya berbeda dikarenakan perbedaan daya serap (adsorption), pertukaran ion (ion exchange), partisi (partitioning), atau ukuran. Perbedaan ini membuat komponen terpisah satu dengan yang lain dan dapat dilihat perbedaannya dari lamanya waktu transit komponen tersebut melewati kolom.

Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya:
a.Reverse phase chromatography
Reverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang kuat dengan memadukan sifat hidrofobik serta rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada padatan inert seperti silika. Metode ini biasa digunakan untuk proses ekstraksi dan pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatile).

b. High performance liquid chromatography
High performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai prinsip yang mirip dengan reverse phase. Hanya saja dalam metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi. Kolom yang digunakan dalam HPLC lebih pendek dan berdiameter kecil, namun dapat menghasilkan beberapa tingkatan equilibrium dalam jumlah besar.

c. Size exclusion chromatography
Size exclusion chromatography, atau yang dikenal juga dengan gel permeation atau filtration chromatography biasa digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein. Metode ini tidak melibatkan berbagai macam penyerapan dan sangat cepat. Perangkat kromatografi berupa gel berpori yang dapat memisahkan molekul besar dan molekul kecil. Molekul besar akan terelusi terlebih dahulu karena molekul tersebut tidak dapat penetrasi pada pori-pori.

4. Kromatografi Pertukaran Ion (Ion-Exchange Chromatography)
Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digukanan untuk pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein. Metode ini dapat dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom maupun ruang datar (planar). Terdapat dua tipe pertukaran ion, yaitu pertukaran kation (cation exchange) dan pertukaran anion (anion exchange). Pada pertukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif; sedangkan pada pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif. Molekul bermuatan yang berada pada fase cair akan melewati kolom. Jika muatan pada molekul sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan terelusi. Namun jika muatan pada molekul tidak sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan membentuk ikatan ionik dengan kolom. Untuk mengelusi molekul yang menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan dengan pH dan kekuatan ionik tertentu. Pemisahan dengan metode ini sangat selektif dan karena biaya untuk menjalankan metode ini murah serta kapasitasnya tinggi, maka metode ini biasa digunakan pada awal proses keseluruhan.